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體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗ISO10993中科院帶頭人黃工
體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗ISO10993中科院帶頭人黃工
  • 體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗ISO10993中科院帶頭人黃工

华东15选5游戏规则: 體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗ISO10993中科院帶頭人黃工

华东15选5浙江风采网 www.hdnka.com 產品報價:1元

更新時間:2018/3/3 22:04:01

地:上海

牌:飛凡檢測

號: ISO10993

廠商性質: 生產型,

公司名稱: 上海飛凡實業有限公司

產品關鍵詞: 體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗   體外哺乳動物細胞染  

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體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗 ISO10993研究基地中科院上海分院,地址:上海市江場西路395號。項目帶頭人:黃工
體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗

In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test

1 范圍

本規范規定了體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗的基本原則、要求和方法。 本規范適用于檢測化妝品原料及其產品的致突變性。

2 規范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997)

3 試驗目的

本試驗是用于檢測培養的哺乳動物細胞染色體畸變,以評價受試物致突變的可能性。 4 定義

染色體型畸變(Chromosome-type aberration):染色體結構損傷,表現為在兩個染色單體相同位點均出現斷裂或斷裂重組的改變。

染色單體型畸變(Chromatid-type aberration):染色體結構損傷,表現為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組的損傷。

染色體數目改變(Numerical aberration):所用細胞株的正常染色體數目的變化。

結構畸變(Structural aberration):在細胞分裂的中期相階段,用顯微鏡檢出的染色體結構改變,表現為缺失、斷片、互換等。

有絲分裂指數(Mitotic index):中期相細胞數與所觀察的細胞總數之比值;是一項反映細胞增殖程度的指標。

5 試驗基本原則

在加入和不加入代謝活化系統的條件下,使培養的哺乳動物細胞暴露于受試物中。用中期分裂相阻斷劑(如秋水仙素或秋水仙胺)處理,使細胞停止在中期分裂相,隨后收獲細胞,制片,染色,分析染色體畸變。

6 試驗方法

6.1 試劑和受試物制備

6.1.1 陽性對照物:可根據受試物的性質和結構選擇適宜的陽性對照物,陽性對照物應是已知的斷裂劑,能引起可檢出的、并可重復的陽性結果。當外源性活化系統不存在時,可使用甲磺酸甲酯(methyl methanesulphonate (MMS))、甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate(EMS))、乙基亞硝基脲(ethyl nitrosourea)、絲裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物(4-nitroquinoline-N-oxide)。當外源性活化系統存在時,可使用苯并(a)芘[benzo(a)pyrene]、環磷酰胺(cyclophosphamide)。

6.1.2 陰性對照物:應設陰性對照,即僅含和受試物組相同的溶劑,不含受試物,其它處理和受試物組完全相同。此外,如未能證實所選溶劑不具有致突變性,溶劑對照與本實驗室空白對照背景資料有明顯差異,還應設空白對照。 6.1.3 受試物

6.1.3.1 受試物的配制:固體受試物需溶解或懸浮于溶劑中,用前稀釋至適合濃度;液體受試物可以直接加入試驗系統和/或用前稀釋至適合濃度。受試物應在使用前新鮮配制,否則就必

須證實貯存不影響其穩定性。

6.1.3.2 溶劑的選擇:溶劑必須是非致突變物,不與受試物發生化學反應,不影響細胞存活和S9活性。首選溶劑是培養液(不含血清)或水。二甲基亞砜(DMSO)也是常用溶劑,使用時濃度不應大于0.5%。 6.1.3.3 受試物濃度設置

(1) 最高濃度的選擇:決定最高濃度的因素是細胞毒性、受試物在試驗系統中的溶

解度以及pH或滲克分子濃度(osmolality)的改變。

(2) 細胞毒性的確定:應使用指示細胞完整性和生長情況的指標,在活化系統存在

或不存在的兩種條件下確定細胞毒性,例如細胞覆蓋程度(degree of confluency)、存活細胞計數(viable cell counts)或有絲分裂指數(mitotic index)。應在預試驗中確定細胞毒性和溶解度。

(3) 劑量設置:①至少應設置3個可供分析的濃度。當有細胞毒性時,其濃度范 圍應包括從最大毒性至幾乎無毒性;通常濃度間隔系數不大于 2 ~。

②在收獲細胞時,最高濃度應能明顯降低細胞覆蓋程度、細胞計 數或有絲分裂指數(均應大于50%)。

③對于那些相對無細胞毒性的化合物,最高濃度應是5μl/mL, 5mg/mL或0.01mol/L。

④對于相對不溶解的物質,當濃度低于不溶解濃度時仍無毒性, 則最高劑量應是,當處理期結束時,在最終培養液中溶解度限 值以上的一個濃度。在某些情況下(即僅當高于最低不溶解濃 度時才發生細胞毒性),應使用一個以上可看見沉淀的濃度。最 好在試驗處理開始和結束時均評價溶解度,因為由于細胞、S9 等的存在,在試驗系統內在暴露過程中溶解度可能變化。不溶 解性可用肉眼鑒別,但沉淀不能影響觀察。

6.1.4 培養液:采用MEM(Eagle),并加入非必需氨基酸和抗菌素(青、鏈霉素,按100IU/mL),胎牛血清或小牛血清按10%加入。也可選用其它合適的培養液。 6.1.5 活化系統

通常使用的是S9混合物(S9 mix)。S9是從經酶誘導劑(Aroclor 1254或苯巴比妥鈉和β-萘黃酮聯合使用)處理的嚙齒動物肝臟獲得的。S9的制備同Ames試驗。S9的使用濃度為1%~10%(終濃度)。S9 mix中所加輔助因子的量由各實驗室自行決定,但需對S9mix的活性進行鑒定,必須能明顯活化陽性對照物。也可使用下述

S9

MgC12 (0.4 mol/L) KC1(1.65mol/L) 葡萄糖-6-磷酸

輔酶Ⅱ(氧化型,NADP) 用無血清MEM培養液補足至1mL.

6.2 試驗步驟

6.2.1 細胞:使用中國地鼠卵巢(CHO)細胞株或中國地鼠肺(CHL)細胞株。 6.2.2 試驗時,應同時設陽性對照物,陰性對照物和至少3個可供分析的受試物濃度組。 6.2.3 試驗前一天,將一定數量的細胞接種于培養皿(瓶)中,放CO2培養箱內培養。 6.2.4 試驗需在加入和不加入S9 mix的條件下進行。試驗時,吸去培養皿(瓶)中的培養液,

0.125ml 0.02 ml 0.02 ml 1.791mg 3.0615mg

加入一定濃度的受試物、S9 mix(不加S9 mix時,需用培養液補足)以及一定量不含血清的培養液,放培養箱中處理2h~6h。結束后,吸去含受試物的培養液,用Hanks液洗細胞3次,加入含10%胎牛血清的培養液,放回培養箱,于24h內收獲細胞。于收獲前2h~4h,加入細胞分裂中期阻斷劑(如用秋水仙素,作用時間為4h,終濃度為1μg/mL)。

當受試物為原料時, 如果在上述加入和不加入S9 mix的條件下均獲得陰性結果,則尚需補加另外的試驗,即在不加S9 mix的條件下,使受試物與試驗系統的接觸時間延長至24h。 當難以得出明確結論時,應更換試驗條件,如改變代謝活化條件、受試物與試驗系統接觸時間等重復試驗。

6.2.5 收獲細胞時,用0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞,待細胞脫落后,加入含10%胎?;蛐∨Q宓吶嘌褐罩掛鵲鞍酌傅淖饔?,混勻,放入離心管以1000r/min~1200r/min的速度離心5min~7min,棄去上清液,加入0.075mol/L KC1溶液低滲處理,繼而以新配制的甲醇和冰醋酸液(容積比為3:1)進行固定。按常規制片,用姬姆薩染液染色。

6.2.6 作染色體分析時,對每一處理組選200個(陽性對照可選100個)分散良好的中期分裂相(染色體數為2n±2)進行染色體畸變分析。在分析時應記錄每一觀察細胞的染色體數目,對于畸變細胞還應記錄顯微鏡視野的坐標位置及畸變類型。

6.3 統計處理:對染色體畸變細胞率用X2檢驗,以評價受試物的致突變性。 6.4 結果評價:在下列兩種情況下可判定受試物在本試驗系統中具有致突變性: (1)受試物引起染色體結構畸變數的增加具有統計學意義,并有與劑量相關的增加。 (2)受試物在任何一個劑量條件下,引起具有統計學意義,并有可重復性的陽性反應。

在評價時應把生物學和統計學意義結合考慮。

7 試驗報告

試驗報告應包括以下內容:

(1)受試物名稱、有關的理化性狀、所用溶劑及其配制、劑量選擇(應說明受試物對細胞毒

性的測定方法、溶解情況等); (2)細胞株名稱; (3)實驗條件和方法

①代謝活化系統:制備S9時所用酶的誘導劑、選用的動物品種和來源、S9mix的配方; ②對照物:陽性對照物名稱和選用濃度;陰性(溶劑)對照物名稱及使用濃度。 ③培養液:所用培養液名稱、血清類別和使用濃度; ④接種時的細胞密度以及所用培養皿(瓶)的規格; ⑤中期分裂阻斷劑:名稱、所用濃度、作用時間; ⑥處理時間:受試物與試驗系統的接觸時間;

⑦簡述制片方法、分析的中期分裂相數目、結果評價方法。 (4)結果

①受試物最高劑量的確定及試驗結果:細胞毒性的測定(建議的表格見表1);溶解情況

(建議的表格見表2);對pH和滲克分子(osmolality)濃度的影響(如果有影響)。 ②各處理組和對照組染色體畸變率(建議的表格見表3)。

③本實驗室的陽性對照組和陰性對照組(常用溶劑,如DMSO)在本實驗室歷史上的染

色體畸變率范圍、均值和標準差(說明樣品數)。 (5)結論。

表1 受試物對細胞的毒性

表2 受試物在所選溶劑中溶解情況記錄

表3 受試物的檢測結果

組 別 陰性對照 受試物

陽性對照

終濃度μg/mL

觀察細胞數 +S9 -S9

畸變細胞數 +S9 -S9

畸變率(%) +S9 -S9

8 結果解釋

陽性結果表明受試物引起培養的哺乳動物體細胞染色體結構畸變。

陰性結果表明在本試驗條件下,受試物不引起培養的哺乳動物體細胞染色體結構畸變。
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